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固定化TCEP二硫鍵還原磁珠

TCEP磁珠可有效還原二硫鍵

使用我們的TCEP還原磁珠，可以輕松減少蛋白質(zhì)和肽中的二硫鍵。我們專(zhuān)門(mén)設計的磁珠不再需要耗時(shí)的分離程序。

簡(jiǎn)介

BcMag ? 固定化TCEP二硫鍵還原試劑盒（TCEP還原磁性基質(zhì)）使用我們專(zhuān)門(mén)設計的磁珠，可有效還原蛋白質(zhì)，多肽和其它含二硫鍵的分子中的二硫鍵（圖1）。TCEP（[三（2-羧乙基）膦]還原磁性基質(zhì)避免了耗時(shí)的實(shí)驗過(guò)程，不需要離心柱和分離柱操作，就可將還原樣品與還原劑分離。

固定化TCEP二硫化物還原磁珠，可以實(shí)現樣品和還原劑的快速分離回收。TCEP是蛋白質(zhì)，多肽和其他含二硫鍵的分子中有效的二硫鍵還原劑，對其他官能團相對無(wú)反應。三烷基膦TCEP在水溶液中穩定，不會(huì )像其他還原劑如二硫蘇糖醇（DTT）和-巰基乙醇（BME）那樣快速氧化。TCEP對常見(jiàn)的巰基反應性化學(xué)物質(zhì)（例如馬來(lái)酰亞胺交聯(lián)劑）幾乎沒(méi)有影響。盡管如此，許多實(shí)驗要求被還原樣品與還原劑需要進(jìn)行分離操作。

磁珠比傳統的色譜法（例如純化柱，瓊脂糖或非磁性樹(shù)脂）具有顯著(zhù)的優(yōu)勢?；诖胖榈母袷娇梢栽诙虝r(shí)間內快速高產(chǎn)率處理96個(gè)樣品，各種樣品的回收率達到95%以上。而當使用基于色譜柱的技術(shù)時(shí)，在學(xué)術(shù)研究實(shí)驗室中處理多個(gè)樣品時(shí)，可能需要大量的手動(dòng)移液操作。這種實(shí)驗方式可能會(huì )造成不同人員進(jìn)行實(shí)驗，目標生物分子回收效率的差異。實(shí)驗員和學(xué)生可能需要廣泛的培訓和實(shí)踐才能實(shí)現穩定的蛋白質(zhì)回收率。相比較傳統方法，磁珠具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如它們易于使用，快速的實(shí)驗方案，適用性以及高通量自動(dòng)化和小型化處理的便利性。

特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：

? 回收率高，不含還原劑-----去除還原劑同時(shí)，在不損失樣品的情況下回收被還原的分子，是DTT或巰基乙醇（BME）很難實(shí)現的。固定化TCEP使您能夠在不進(jìn)行透析或脫鹽的情況下，以高收率（90%或更高）回收蛋白質(zhì)/多肽。

? 無(wú)任何異味----與DTT或BME不同，固定化TCEP是無(wú)味的，可以在普通操作臺上進(jìn)行還原。

? 穩定性好-----固定化的TCEP穩定性消除了在處理，使用或儲存固定化的TCEP二硫化物還原磁珠時(shí)，需要進(jìn)行防止氧化的特殊措施的需要。

易于使用-----固定化TCEP還原磁珠，在您使用時(shí)，可根據需要分配每個(gè)實(shí)驗所需的用量?？梢栽诓煌?/span>pH值（從4到9）和溫度（5到95°C）下進(jìn)行還原反應。

操作說(shuō)明

注意事項：

· 還原發(fā)生在較寬的pH（pH 4.0-9.0）和溫度范圍（5°-95°C）內。

· 大多數蛋白質(zhì)可以在不使用變性劑的情況下有效還原。然而，添加變性劑如6M鹽酸胍，將有助于將內部二硫化物暴露出來(lái)，與固定的TCEP反應，確保完全還原。不建議使用尿素作為變性劑，因為它會(huì )產(chǎn)生與巰基反應的氰酸鹽。

· 在還原過(guò)程中，樣品緩沖液中加入5-20 mM EDTA可防止二價(jià)離子（例如Zn2+，Cu2+和Mg2+）使巰基再氧化。

· 由于二硫化物會(huì )隨著(zhù)時(shí)間的推移而再生，因此還原后的樣品應在還原后立即使用。

· TCEP固定的磁珠僅為一次性使用產(chǎn)品。

以下方案是二硫化物還原的一個(gè)例子。為了獲得最佳結果，我們建議進(jìn)行滴定以?xún)?yōu)化每次實(shí)驗所用的磁珠量。該協(xié)議可以按比例放大/縮小。

緩沖液：

? 20Mm EDTA

? dH2O（Milli-Q超純水）

設備

操作過(guò)程

A. 磁珠制備

1. 用用dH2O懸浮所需用量的磁珠，最終濃度為50 mg/ml。

注意：為了獲得最佳效果，請現配現用磁珠。懸浮的磁珠可以在4oC下保存一周而不會(huì )降低活性。

2. 使用前搖動(dòng)或渦旋試劑瓶，以完全懸浮磁珠。

注意：在分配之前，不要讓磁珠放置超過(guò)2分鐘。

B. 樣品制備

1. 將所需量的磁珠轉移到離心管中。

注意：優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗使用的磁珠數量。通常，對于30-50μl蛋白質(zhì)/多肽樣品（50-80μg），需使用30-50μl（3mg-5mg磁珠）的TCEP二硫化物還原磁珠。

2. 將試管放在磁力分離器上1-3分鐘，直到上清液變清。在試管保持在磁力分離器上的同時(shí)，除去上清液。

3. 加入樣品，并通過(guò)緩慢上下移液25次（一分鐘）或通過(guò)渦旋混合器以2000 rpm的速度完全混合5分鐘，混勻樣品。

4. 將它們在室溫下，溫和旋轉孵育1小時(shí)。

5. 將試管放在磁力分離器上1-3分鐘，直到上清液變清。在試管保持在磁力分離器上的同時(shí)，除去上清液。

故障排除

參考文獻

1.Zwyssig A, Schneider EM, Zeltner M, Rebmann B, Zlateski V, Grass RN, Stark WJ. Protein Reduction and Dialysis-Free Work-Up through Phosphines Immobilized on a Magnetic Support: TCEP-Functionalized Carbon-Coated Cobalt Nanoparticles. Chemistry. 2017 Jun 27;23(36):8585-8589.

2.Tzanavaras PD, Mitani C, Anthemidis A, Themelis DG. On-line cleavage of disulfide bonds by soluble and immobilized tris-(2-carboxyethyl)phosphine using sequential injection analysis. Talanta. 2012 Jul 15;96:21-5. 

3.Han J, Clark C, Han G, Chu TC, Han P. Preparation of 2-nitro-5-thiobenzoic acid using immobilized Tris(2-carboxyethyl)phosphine. Anal Biochem. 1999 Mar 15;268(2):404-7.

4.Han, J.C., et al.  A procedure for quantitative determination of tris(2-carboxyethyl)phosphine, an odorless reducing agent more stable and effective than dithiothreitol. Anal Biochem (1994) 220:5-10