產(chǎn)品中心
PRODUCT CENTER
一步法染料清除磁珠
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貨號 |
產(chǎn)品名稱(chēng) |
產(chǎn)品規格 |
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BG101 |
BcMag? 一步法染料清除磁珠 |
1 ml |
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BG102 |
BcMag? 一步法染料清除磁珠 |
5 ml |
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產(chǎn)品信息 |
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組成 |
二氧化硅基質(zhì)，表面覆蓋有高密度專(zhuān)有化學(xué)基團的磁珠 |
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穩定性 |
短期保存 (<1小時(shí)): pH 3-11; 長(cháng)期保存: pH 4-10 溫度: 4°C -140°C; 可溶于大多數有機溶劑 |
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磁化強度 |
~40-45 EMU/g |
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磁化類(lèi)型 |
超順磁 |
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成分 |
100 mg / ml溶于d2H2O |
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儲存 |
室溫運輸，收到后保存在 4°C . |
簡(jiǎn)介
熒光染料，也稱(chēng)為活性染料或熒光團，是一種天然或合成的化合物，可以吸收光并以更長(cháng)的波長(cháng)重新發(fā)光。由于熒光染料的多功能性、高靈敏度和定量能力等獨特優(yōu)勢，熒光染料被廣泛用于標記蛋白質(zhì)、抗體、多肽、配體、DNA和RNA等生物相關(guān)分子，用于細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究。熒光標記反應完后，通常需要從最終的共軛反應體系中去除多余或未反應的染料，因為它會(huì )干擾許多下游應用。去除熒光染料方法通常使用離心柱法、凝膠過(guò)濾法或重力流柱和透析法等方式來(lái)完成。然而，這些傳統方法存在許多問(wèn)題，包括費時(shí)費力的操作過(guò)程，蛋白質(zhì)、多肽或核酸的回收率低，以及不適應自動(dòng)化的程序。為此，我們研發(fā)出了一種新型的一分鐘脫色系統。
BcMag? One-Minute Dye Removal Magnetic Beads采用獨特設計和專(zhuān)利表面化學(xué)修飾的磁珠，專(zhuān)門(mén)去除生物分子標記反應中多余的游離（非共軛）熒光染料。本款磁珠操作方便僅需單步單管，完成凈化方案只需1分鐘，實(shí)際操作時(shí)間非常短（圖1）。本款磁珠可以在不到10分鐘的時(shí)間內同時(shí)處理96個(gè)樣品。由于磁珠表明的磁性樹(shù)脂材料只吸附游離染料，標記的生物分子回收率極高且>90%。此外，如果使用適當的樣品量和緩沖條件，磁珠可以去除絕大部分染料。
工作流程
使用程序非常簡(jiǎn)單（圖1）。1.直接將磁珠添加到樣品中。2.用移液器吹吸或渦旋方式捕捉游離染料。3.磁珠從蛋白質(zhì)或DNA/RNA溶液中分離出來(lái)，而上清液中含有純化后的生物樣品。
優(yōu)勢及特點(diǎn)
l 簡(jiǎn)單的操作過(guò)程：無(wú)液體轉移，僅需一管，一步操作，過(guò)程僅需1分鐘
l 方便快捷
l 結果真實(shí)可靠可重復性高：對于蛋白質(zhì)（>6 kDa，抑肽酶）或DNA/RNA（>25mer雙鏈DNA）樣品回收率>90%。
l 高效的清除效率：可去除95%的游離染料
l 性?xún)r(jià)比高：無(wú)需離心柱、過(guò)濾器、不用反復的重復移液和使用有機試劑。
l 可用于高通量實(shí)驗：與許多不同的全自動(dòng)核酸提取系統兼容。
操作協(xié)議
材料準備
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Item |
Source |
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磁力分離器
**根據樣品體積，用戶(hù)可以選擇以下磁力分離器之一 |
l BcMag? separator-2 適用于兩個(gè)單獨的1.5毫升離心管 (Bioclone, Cat.# MS-01); l BcMag? separator-6 適用于六個(gè)單獨的1.5毫升離心管 (Bioclone, Cat.# MS-02); l BcMag? separator-24 適用于24個(gè)單獨的1.5-2.0 ml離心管 (Bioclone, Cat.# MS-03); l BcMag? separator-50 適用于1個(gè)單獨的50毫升離心管，1個(gè)單獨的15毫升離心管, 以及4個(gè) 1.5毫升 離心管 (Bioclone,Cat.# MS-04）
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BcMag 96孔磁力分離器 |
l BcMag 96-well Plate Magnetic Separator (side-pull,) 或者 96-well PCR plate 和 96-well microplate, 或其他兼容的磁力分離器(Blioclone, Cat#: MS-06) |
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可調單通道和多通道移液器 |
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擺動(dòng)式離心機 |
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如果使用96孔PCR板/管，則需要添加項目 |
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渦懸混合器 **用戶(hù)還可以使用其他型號的渦懸混合器。但是，時(shí)間和速度應進(jìn)行優(yōu)化，并且混合器應滿(mǎn)足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 轉速 ≥ 2000 rpm |
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Eppendorf? MixMate? |
Eppendorf, Cat#:5353000529 |
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Tube Holder PCR 96 |
Eppendorf, Cat#: 022674005 |
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Tube Holder 1.5/2.0 mL, for 24?×?1.5 mL or 2.0 mL |
Eppendorf, Cat#: 022674048 |
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Smart Mixer, Multi Shaker |
BenchTop Lab Systems, Cat#:5353000529 |
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1.5/2.0 mL 離心管 |
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96孔PCR板或者 8孔 PCR 管 |
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PCR 板/管 ** IMPORTANT! 如果使用其他管或PCR板，確保PCR管或PCR板錐形部分底部的井徑必須≥2.5毫米。 |
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操作過(guò)程
重要提示：
l 以下操作過(guò)程僅是個(gè)例。操作過(guò)程中磁珠用量以及樣品體積可以根據需要放大或縮小。不要使用含有有機溶劑的緩沖液。
l 用戶(hù)應根據表1中列出的結合能力優(yōu)化磁珠和染料濃度的比例。
表1：染料結合力表
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熒光染料 |
結合能力 ng /mg beads** |
熒光染料 |
結合能力 ng /mg beads** |
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Alexa Fluor 546 C5-Maleimide |
99.7 |
Alexa Fluor? 514 NHS Ester |
45.2 |
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Cyanine 3 carboxylic acid |
99.1 |
Cyanine 5 carboxylic acid |
49.7 |
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Cyanine 3 amine |
99.3 |
Cyanine 3.5 carboxylic acid |
99 |
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Cyanine 5.5 amine |
99.8 |
Cyanine 5.5 carboxylic acid |
99.7 |
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Cyanine 5 amine |
49.85 |
Sulfo-Cyanine 5.5 amine |
99.9 |
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Sulfo-Cyanine3 amine |
93.3 |
Sulfo-Cyanine5 carboxylic acid |
24.9 |
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DyLight? 488 NHS Ester |
90.5 |
DyLight? 633 NHS Ester |
87.4 |
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Dylight 680-4x PEG NHS Ester |
99.8 |
DyLight? 405 NHS Ester |
99 |
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Oregon Green? 488 carboxylic acid |
84.2 |
FAM amine, 5-isomer |
24.57 |
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Rhodamine 5B amine |
99.2 |
Texas Red? hydrazide |
890 |
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Cibarcron blue F3GA |
99.7 |
Fluorescein isothiocyanate |
120.3 |
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Bromocresol purple |
105.2 |
Phenol red |
99.5 |
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Denim red |
101 |
Bromophenol blue |
99 |
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Denim blue |
104.2 |
SYBR? dye |
102.4 |
**結合能力測定條件：在0.1M磷酸鈉、0.15M NaCl、pH7緩沖液中，將10μl磁珠（100 mg/ml）和100μl含有不同的染料濃度為50 ng-800 ng的蛋白質(zhì)樣品（1:400稀釋的人血清）混合。并以2000 rpm的轉速旋轉5分鐘。染料去除率>93%，蛋白質(zhì)回收率>95%。
1. 將樣品pH值調整至6.5至9.0，并將NaCl濃度調整至150 mM。
2.震動(dòng)試劑瓶，使磁珠完全重新懸浮，直至均勻。
重要提示：
l 分液前必須將磁珠混合。
l 在分液完成前，不要讓磁珠溶液靜置停留超過(guò)2分鐘。每2分鐘重新懸浮一次磁珠。
3.向含有游離洗滌劑的100μl樣品中添加10μl磁珠。
重要提示：由于染料的結合能力不同，樣品中染料的濃度也不同，用戶(hù)需要優(yōu)化磁珠和生物樣品添加的比例。
4. 在1-2分鐘內緩慢上下移液吹吸20-25次，將樣品與磁珠混合。
5.將含有樣品的試管放在磁力分離器上30秒或直到溶液澄清。
6.將上清液轉移到另一個(gè)干凈的板/管中，同時(shí)將原樣品板保留在磁力分離器上。純化好的樣品已可以用于下游應用。
問(wèn)題及解決
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問(wèn)題 |
可能原因 |
建議 |
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蛋白回收率低 |
渦旋時(shí)間太長(cháng)
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· 如果使用其他型號的渦旋振蕩器，則必須優(yōu)化渦旋條件，如速度和時(shí)間。 |
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磁珠用量太多 |
完全重新懸浮磁珠，并減少磁珠的用量。 |
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染料清除失敗 |
使用了不合適的PCR試劑管或PCR板 |
確保試劑管或板錐形部分底部的井徑為≥2.5毫米。 |
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渦旋速度太慢或者渦旋時(shí)間太短
樣品中含有太多游離的染料 |
· 增加速度或者時(shí)間 · 如果使用其他型號的渦旋振蕩器，則必須優(yōu)化渦旋條件，如速度和時(shí)間。 · 重復操作過(guò)程使用更多的磁珠 |
參考文獻
1. Hayashi-Takanaka, Yoko et al. "Evaluation of chemical fluorescent dyes as a protein conjugation partner for live-cell
imaging." PloS one vol. 9,9 e106271. 3 Sep. 2014,
2. Gui, W., Lin, J., Liang, Y. et al. A two-step strategy for high-efficiency fluorescent dye removal from wastewater. npj Clean
Water 2, 16 (2019).
3. Hoffman A, Atreya R, Rath T, Neurath M, F: Use of Fluorescent Dyes in Endoscopy and Diagnostic Investigation. Visc Med
2020;36:95-103.
4. Hawe, Andrea et al. “Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization.” Pharmaceutical research vol. 25,7
(2008): 1487-99.
